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馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒法的操作步驟

時間:2020-07-01 18:21來源: 作者:班德液氮罐 點擊:
馬鈴薯莖尖超低溫冷凍脫毒方法一般按照選擇材料、切取莖尖、預培養(yǎng)、預處理、超低溫冷凍、解凍、恢復培養(yǎng)、脫毒效果檢測、組織培養(yǎng)擴繁這幾個步驟來獲得再生植株,經(jīng)過病毒檢測后,無毒植株用于生產(chǎn)脫毒馬鈴薯種薯(圖2)。液氮罐

 

1. 選擇材料

馬鈴薯不同部位的組織經(jīng)過超低溫冷凍處理后細胞的存活力有明顯差異。一般細胞體積小細胞質(zhì)較濃、液泡少的分生組織細胞會比液泡大的成熟的分化細胞再生能力強、成苗率也高。研究發(fā)現(xiàn)選擇馬鈴薯莖尖分生組織作為處理對象,可以提高成苗率,有利于獲得脫毒苗。

2. 預培養(yǎng)材料

材料通過預培養(yǎng)使得細胞適度脫水,減少細胞內(nèi)自由水含量,可以提高細胞的抗冷凍能力,從而提高成活率。目前*常用的預培養(yǎng)方式是在培養(yǎng)基中添加一些使細胞脫水的保護性物質(zhì),可以選用蔗糖、二甲基亞砜、甘露醇等。在高濃度保護性物質(zhì)處理之前選用0~5℃的低溫馴化,可以明顯提高成活率。馬鈴薯莖尖可以切取2~3mm大小,然后放在0.3mol·L-1高蔗糖濃度的預培養(yǎng)基中預培養(yǎng)一天,光照16h,光照強度2000lx。高濃度的蔗糖可增加培養(yǎng)基的滲透壓,使得馬鈴薯莖尖組織的細胞脫水,從而減少細胞內(nèi)自由水的含量。

3. 保護劑處理

常用的抗冷凍保護劑是能夠穿透細胞膜的化合物DMSO和各種糖類物質(zhì),通過促進細胞膜對水分的通透性,降低細胞內(nèi)水分冰點溫度,避免胞內(nèi)外冰晶形成,保護細胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)。保護劑的選擇是超低溫處理成功的關鍵因素,好的保護劑應該滿足對細胞毒性小、易溶于水、解凍后容易從細胞中清洗掉等要求。目前常用Sakai于1990年創(chuàng)立的按照一定配方合成的多種保護劑復合液,被稱為植物材料玻璃化溶液(plant vitrification solution,PVS)。將預培養(yǎng)一天后的馬鈴薯莖尖加載到PVS2溶液中,其中PVS2液的成分為:MS+30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)二甲基亞砜(DMSO)+0.4mol·L-1蔗糖。具體方法是用移液管吸取15μL的PVS2溶液加在0.03mm厚的1.0cm×4.0cm的鋁箔上,然后將預培養(yǎng)后的馬鈴薯莖尖裝載到PVS2液滴中,室溫25℃下處理20min,成活率可達90%。

4.液氮冷凍處理

將包裹有馬鈴薯莖尖的鋁箔在液氮中蘸一下,然后把鋁箔條放入1.5mL離心管中,再將離心管置于液氮中超低溫處理1h。

5. 解凍洗滌

對超低溫處理后的材料需要馬上進行解凍,常用的解凍方法有兩種:一是快速解凍法,適合于大多數(shù)材料,具體做法是將液氮中冷凍1小時后的材料放于25~40℃的水浴鍋中進行解凍1~3min完全融化后取出材料,避免水浴溫度對細胞的熱傷害以及保護劑對細胞的毒害作用。另一種是慢速解凍法,適用于經(jīng)過低溫馴化或者經(jīng)過脫水處理的材料,把液氮處理1h后的材料在0℃下慢速解凍30min左右。解凍后的材料一般都需要立刻洗滌,為了除去細胞內(nèi)含的高濃度保護劑,避免對恢復培養(yǎng)的影響。*常用的洗滌方法是室溫下用含1~2mol·L-1蔗糖濃度的培養(yǎng)基洗滌10min左右。在無菌超凈工作臺中,將液氮處理1h后的包裹馬鈴薯莖尖鋁箔條從離心管中取出,然后迅速放入加有1.2mol·L-1蔗糖濃度的液體MS培養(yǎng)基中洗滌2~3次,每次10min。液氮罐

6. 恢復培養(yǎng)

經(jīng)過洗滌后的材料需要立即轉(zhuǎn)移到恢復培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)將材料先培養(yǎng)在黑暗或弱光下一段時間后,再在正常光照下有利于形成再生植株。

將洗滌后的馬鈴薯莖尖在無菌超凈工作臺中取出,用無菌紙吸去殘留在材料表面的洗滌培養(yǎng)基,接種到固體恢復培養(yǎng)基(MS+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3)上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件選擇先黑暗培養(yǎng)7d,再在弱光1000lx下培養(yǎng)7d,然后正常光照2000lx培養(yǎng)。當分化出根芽后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上,1個月就可獲得完整植株,統(tǒng)計成活率。

7. 病毒檢測

對再生馬鈴薯試管苗用酶聯(lián)免疫法進行病毒檢測,只有不帶病毒的組培苗才可以進行組織培養(yǎng)擴繁,用于生產(chǎn)無毒馬鈴薯種薯。液氮罐
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